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银杏叶提取物对大鼠肝硬化的治疗作用及其机制研究

时间:2017-12-13 12:00:04来源:www.xielunwen.net 作者:admin 点击: 19 次
【摘要】目的研究银杏叶提取物(extractofginkgobiloba,EGb)对大鼠肝硬化的影响并探讨其机制。方法用四氯化碳加高脂饮食法造成大鼠肝硬化模型,银杏叶片以20mg/kg、15mg/kg、10mg/kg的量给药30天,测定血清总蛋白(T-P)、白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、血清透明质酸(HA)、层粘蛋白(LN)和Ⅲ型前胶原(PCⅢ)的含量,
【摘要】 目的 研究银杏叶提取物(extract of ginkgo biloba,EGb)对大鼠肝硬化的影响并探讨其机制。 方法 用四氯化碳加高脂饮食法造成大鼠肝硬化模型,银杏叶片以20 mg/kg 、15mg/kg、10m g/kg的量给药30天,测定血清总蛋白(T-P)、白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、血清透明质酸(HA)、层粘蛋白(LN)和Ⅲ型前胶原(PCⅢ)的含量,计算白蛋白与球蛋白的比例(A/G)。TUNEL测肝细胞凋亡指数。  结果 与模型组相比,银杏叶提取物各组能显著降低ALT、AST、TBIL含量,增加白蛋白含量,提高白/球比例,显著降低血清HA、LN和PCⅢ水平;显著降低细胞凋亡指数。并具有剂量依赖性。 结论 银杏叶提取物对大鼠肝硬化具有保护作用,其机制可能是通过抗肝细胞凋亡来实现的。
【关键词】 银杏叶提取物 肝硬化  肝细胞 细胞凋亡 
        银杏树叶的提取物(extract of ginkgo biloba,EGb)具有扩张血管,调节血脂,抑制血栓形成;改善记忆;清除自由基等多种药理作用。临床用于治疗心脑血管方面的疾病和癌症。已发现银杏叶提取物对肝纤维化、肝癌等具有一定的治疗作用??〔1-6〕,临床上已有银杏叶提取物成功用于治疗失代偿期肝硬化的例子,本文主要研究银杏叶提取物??银杏叶片(每片含总黄酮醇苷9.6mg,萜类内脂2.4mg)对大鼠肝硬化的作用,并进行初步的机制探讨。
        1 材料与方法
        1.1 试验材料:
        实验动物:60只SD大鼠,体重180-220g,购自河南省实验动物中心。动物合格证号:SCXK(豫)2005-0001,动物房温度为25±2℃,标准大鼠颗粒饲料饲养,自由饮水。
        银杏叶片,扬子江药业集团生产,批号08011301。使用时用0.5%的CMC-Na混悬,配成不同浓度。
        1. 2 主要试剂及仪器 :
        四氯化碳(CCl4):郑州化学试剂二厂;羧甲基纤维素钠(CMC-Na):上海浦东化学品有限公司,批号:20071026;透明质酸(HA)、层粘蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)放免试剂盒均购自北京北方免疫试剂研究所;其它试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。BT2000全自动生化分析仪,意大利Vialicenza,Roneoo156。TUNEL 试剂盒, 购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
        1.3 模型制备 :
        60只大鼠适应性饲养1周,随机分为造模组50只和正常组10只。采用复合造模方法复制大鼠肝硬化模型??〔7〕?,每周2次皮下注射四氯化碳,0.3ml/100g体重,共10周。造模开始第1-2周均以20%猪油、0.5%胆固醇、79.5%玉米面混合饲料喂养,第3-9周以0.5%胆固醇和99.5%玉米面混合饲料喂养。整个造模期间以30%乙醇作为饮料让大鼠自由饮用。正常组则以正常饲料和纯净水喂养。造模过程中死亡3只。实验10周末造模组随机抽取3只经肝组织病理切片确认造模成功后予以分组治疗。
  将造模成功的44只大鼠随机分为4组,每组11只,即模型组、EGb 高、中、低剂量组,分别灌胃给予0.5%的CMC-Na及20m g/kg 、15mg/kg、10m g/kg的EGb。给药30天,给药过程中模型组死亡一只。给药结束后,大鼠禁食14小时,戊巴比妥钠麻醉,腹主动脉取血后处死动物,取肝脏。离心分离血清,全自动生化分析仪测定血清总蛋白(T-P)、白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)含量,计算白蛋白/球蛋白(A/G)比例;放免法测定血清中HA、LN、PCⅢ含量。肝细胞凋亡原位检测按照试剂盒说明书操作进行,凡满足下列条件之一者即确定为凋亡肝细胞:(1)出现凋亡小体;(2)核呈新月形;(3)核浓缩。每张切片选择5个具有代表性的高倍视野(400×),共计数500个肝细胞,取阳性细胞平均百分率作为凋亡指数(Apoptosis index,AI),即:凋亡指数=(5个高倍视野内阳性肝细胞数之和/500)×100%。
  1.4 统计学处理:
  所有数值以±S,利用SPSS11.0软件进行单因素方差分析、两两比较及相关性分析,p<0.05具有显著性差异,p<0.01具有极显著性差异。
        2 结果
  2.1 银杏叶片对肝硬化大鼠血清中ALT、AST、TBIL的影响:
  肝硬化模型建立后,肝细胞受损,细胞中的酶释放进入血液中,导致血清中ALT、AST含量明显升高;同时,肝功能受损时,胆红素不能与葡萄糖醛酸结合进入胆汁而在血液中蓄积,引起血液中总胆红素水平升高。经EGb干预后,与模型组相比,银杏叶提取物高中低剂量组可明显降低血清中ALT、AST、TBIL的含量,并呈剂量依赖性。
  2.2 银杏叶片对肝硬化大鼠血清中T-P、ALB、A/G的影响
  肝硬化大鼠肝脏受损后,合成蛋白质的能力下降,从而导致T-P、ALB的量降低,同时肝细胞损伤时球蛋白生成增加,故A/G显著降低。经银杏叶提取物干预后,与模型组相比,银杏叶提取物各剂量组可显著升高T-P、ALB和A/G。
  2.3 银杏叶提取物对肝纤维化大鼠血清中HA、LN、PCⅢ水平的影响
        2.4 对凋亡指数的影响:
  正常组肝组织中TUNEL染色阳性肝细胞较少见,多散在分布于中央静脉周围。模型组可见不同程度的TUNEL染色阳性肝细胞,发生凋亡的肝细胞常位于脂肪变严重以及炎症细胞浸润区域附近,随着脂肪肝程度以及肝细胞炎症、坏死的加重,其肝细胞凋亡指数明显增高。给予EGb后发现TUNEL染色阳性肝细胞减少,与模型组相比,EGb高、中剂量组肝细胞凋亡指数明显降低。
        3 讨论
  肝硬化是肝脏慢性反复损伤后肝脏细胞外基质(ECM)合成与降解之间平衡失调、细胞外基质过度沉积的结果。当肝细胞被破坏、细胞膜通透性增高及线粒体损伤时,AST和ALT被释放到血液中,使之明显升高,酶活性的高低与肝细胞受损的程度相一致;肝细胞受损时,胆红素不能与葡萄糖醛酸结合进入胆汁而在血液中蓄积,引起血液中总胆红素(TBIL)水平升高。此外,血清白蛋白主要是由肝细胞合成的,肝功能损害时,血清白蛋白水平下降,而由免疫器官产生的球蛋白量增加。慢性肝炎和肝硬化患者的白蛋白产生减少,同时球蛋白产生增加,造成A/G比值倒置。本实验结果显示,银杏叶提取物各剂量组可显著降低肝纤维化大鼠血清AST、ALT水平,提高T-P、ALB含量和A/G比例,表明银杏叶提取物具有保护肝细胞,改善肝功能的作用。
        PCⅢ、HA、LN分别是胶原蛋白、蛋白多糖、粘连糖蛋白三种细胞外基质成份的代表。Gabrielli等〔8〕认为PCⅢ、HA、LN 三项指标在各型肝炎中随肝脏受损程度而变化,分别在急性肝炎、慢性肝炎和肝硬化之间依次升高。其升高幅度与肝组织增生程度呈现良好的正相关。血清PCⅢ反映了肝内胶原代谢的变化〔9〕,肝脏间质细胞合成HA增加或肝窦内皮细胞摄取HA减少均可引起血清HA升高〔10〕,血清LN值被认为是反应基底膜更新率的指标,可反映肝窦毛细血管化和汇管区肝脏受损的范围〔11〕。本试验结果表明,EGb各剂量组可明显降低大鼠血清PCⅢ、HA及LN,提示EGb可减少肝细胞合成HA或增加肝窦内皮细胞摄取HA,降低基底膜的更新率,抑制肝硬化的发展。由此表明EGb具有保护肝细胞、抑制肝硬化发展的作用。 (责任编辑:admin)
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