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冠心病痰瘀证候与E选择素G98T及S128R基因多态性的关系研究

时间:2018-05-08 12:00:02来源:www.xielunwen.net 作者:admin 点击: 86 次
作者:洪永敦,朱会英,陈宇鹏,吴辉,莫鸿辉,黄衍寿,史成军 【摘要】【目的】从基因多态性角度探讨冠心病痰瘀证的实质。【方法】入选107例研究对象(其中正常组20例,冠心病组87例),应用聚合酶链反应?限制性片段长度多态性(PCR?RFLP)核苷酸分型技术检测血清E选择素(E?selectin)G98T及S128R基因型,同时采用酶联免疫吸附法测定血清E?

            作者:洪永敦,朱会英,陈宇鹏,吴辉,莫鸿辉,黄衍寿,史成军

【摘要】  【目的】从基因多态性角度探讨冠心病痰瘀证的实质。【方法】入选107例研究对象(其中正常组20例,冠心病组87例),应用聚合酶链反应?限制性片段长度多态性(PCR?RFLP)核苷酸分型技术检测血清E选择素(E?selectin)G98T及S128R基因型,同时采用酶联免疫吸附法测定血清E?selectin浓度。【结果】冠心病痰瘀证组E?selectin G98T的GG基因型、G等位基因,E?selectin S128R的SR基因型、R等位基因频率高于正常组,但经过统计学分析,两者之间差异无显著性意义(P>0?05)。冠心病痰瘀证型组患者血清E?selectin水平高于正常组(P<0?01)。【结论】冠心病痰瘀证可能与E选择素G98T的G等位基因、E选择素S128R的R等位基因有一定的相关性。

【关键词】  冠状动脉疾病;痰证;血瘀;E选择素/血液

冠心病是严重影响人类健康生活的疾病之一,炎症在冠心病的形成发展过程中起着重要作用。遗传流行病学研究显示冠心病的发病有遗传因素的作用,目前相继发现一些基因多态性影响脂质代谢、炎症反应、血栓形成及血管收缩与舒张等病理生理过程,与冠心病发生的危险性增加关系密切。痰瘀证候是冠心病的常见证候。本研究采用聚合酶链反应?限制性片段长度多态性方法(PCR?RFLP)检测冠心病痰瘀证候患者的血清E选择素(E?selectin)G98T及S128R基因型,以期发现其中的内在联系。现将结果报道如下。

    1研究对象

    1?1资料来源研究对象均来源于2006年2月~2007年3月在广州中医药大学第一附属医院心内科临床确诊为冠心病心绞痛和急性心肌梗死的住院病例(部分病例经冠状动脉造影明确诊断);同时设立正常组作为对照(正常组为健康志愿者)。所有研究对象均为汉族广东省常住人口。

    1?2诊断标准诊断标准参照1979年国际心脏病学会及世界卫生组织关于缺血性心脏病的诊断[1];辨证标准参照中华人民共和国中医药行业标准(1994年)《中医病证诊断疗效标准》[2]中的胸痹心痛辨证分型及沈绍功等[3]《中医心病诊断疗效标准与用药规范》。具体中医辨证标准如下:(1)痰浊证组:胸脘闷痛痞满,口黏乏味,纳呆脘胀,苔腻或黄或白滑,脉滑或数。(2)血瘀证组:胸脘刺痛固定,面晦唇青,怔忡不宁,舌质紫暗或见紫斑或舌下脉络紫胀,脉涩或结代。(3)痰瘀证组:胸痛(心前区痛或痛引肩背)或胸脘痞满,舌质紫暗,或有瘀点、瘀斑,舌苔厚腻,脉弦或滑。同时具备以上四大主症者可辨证为痰瘀证。

    1?3一般资料入选研究对象共107例,其中正常组20例,男6例,女14例,平均年龄为(64?15±12?22)岁,体质量指数为(23?76±2?91)kg/m2。冠心病组87例,其中痰瘀证组55例,男38例,女17例,平均年龄为(64?87±12?91)岁,体质量指数为(24?68±3?33)kg/m2;血瘀证组20例,男11例,女9例,平均年龄为(63?30±10?26)岁,体质量指数为(24?94±2?54)kg/m2;痰浊证组12例,男8例,女4例,平均年龄为(54?75±11?86)岁,体质量指数为(24?18±2?80)kg/m2。各组在年龄、性别、体质量指数方面比较差异无显著性意义(P>0?05),具有可比性。

    2研究方法

    2?1标本收集选择血清/全血作为观察样本,病人入院后次日凌晨6时进行采血,标本放置于冰箱,并于当日对所需血清标本进行以3000r/min离心10min,取上清液,置于-30℃冰箱保存,全血标本置于-70℃冰箱保存。

    2?2检测指标及方法E?selectin浓度采用酶联免疫吸附法测定(试剂盒由美国R&D公司提供),由本院实验中心完成;采用聚合酶链反应?限制片段长度多态性(PCR?RFLP)基因分析法检测E?selectin G98T及S128R基因型,由中山大学组织配型中心完成。血清E?selectin酶联免疫法测定具体操作方法:(1)血清标本置于室温下解冻;(2)按说明准备试剂、标准品及样本;(3)每孔加入100μL测定稀释液;(4)每孔加入100μL标准品或已稀释的样本。室温下在振荡机上以(500±50)r/min进行振荡,孵育1?5h;(5)抽吸清洗6次,将微孔在吸水纸上扣干;(6)每孔加入100μL酶联物,室温下振荡孵育30min;(7)每孔加入100μL显色液,室温避光孵育1h;(8)每孔加入50μL终止液,30min内在450nm处读D值;(9)以D值为纵坐标,以标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线。根据血清样品的D值可在标准曲线上查出其浓度。G98T及S128R基因多态性的关系研究E?selectin G98T及S128R基因型检测的PCR?RFLP基因分析法:(1)使用试剂:DNA分子标准DL2000 Marker(大连宝生物公司)、QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen公司产品)、Taq DNA Polymerase(北京索奥公司产品)、DNTPs(北京索奥公司产品)、HphI限制性内切酶(NEB公司产品)、PstI限制性内切酶(TAKARA公司产品);(2)外周血白细胞DNA的提取(操作方法按照试剂的说明书进行):全部受试者均取外周静脉血2mL,EDTA抗凝,采用Qiagen DNA抽提试剂盒提取基因组DNA,步骤如下:①取1?5mL离心管,注明名字及编号;②管底加ProteaseK 20μL,全血200μL,Buffer AL 200μL,混匀后56℃水浴10min;③取无水乙醇200μL加入管中,混匀,转移入Spin Column,8000r/min离心5min;④弃滤液,Spin Column转移入清洁收集管中,加AW1液500μL,8000r/min离心5min;⑤弃滤液,Spin Column转移入另一清洁管中,加AW2液500μL,8000r/min离心5min;⑥弃滤液,Spin Column转移入已标名字的1?5mL离心管中,加Buffer AE或蒸馏水200μL,8000r/min离心5min;-20℃保存备用。(3)聚合酶链反应:①引物序列:引物序列参考文献[9]并结合Primer Express? Software 2?0版设计,引物序列见表1,全部引物由Invitrogen 公司合成。②反应体系:10倍PCR Buffer 5μL、10mmoldNTPs1μL、上下游引物各10pmol、Taq酶3U、膜板5μL、加无菌去离子水至50μL。③反应条件:93℃3min预变性,93℃30s,各外显子参照上述退火温度,共35个循环,72℃延伸10min。反应后检测,取8μLPCR扩增产物用20g/L的琼脂糖凝胶进行电泳,PCR产物在20g/L琼脂糖中电泳检测后-20℃保存备用。④结果:PCR产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定,片段大小符合预先设计。(4)PCR限制性片段长度多态性分析(PCR?RFLP):①HphI反应体系:PCR 反应混合物 10μL(约1μg of DNA),10倍NEB Buffer2μL,HphI 1μL,加水、无核酸酶试剂至20μL,温和震荡,短暂离心数秒。37℃酶切过夜。取10μL酶切产物用20g/L琼脂糖凝胶进行电泳;②PstI反应体系:PCR 反应混合物 10μL(约 1μgof DNA),10倍H Buffer 2μL,PstI 1μL,加水、无核酸酶试剂至20μL,温和震荡,短暂离心数秒。37℃酶切4h。取10μL酶切产物用20g/L琼脂糖凝胶进行电泳。

    表1PCR引物序列

    Table 1PCR primer sequence基因PCR 引物(5?→3?)退火温度(℃)长度(bp)G98TTGCCCAAAATCTTAGGATGCAAGCCCAGGGAAGAACACAT59332S128RAGTAATAGTCCTCCTCATCATGACCATCTCAAGTGAAGAAAGA55186

    2?3统计学方法采用SPSS 11?5软件包进行分析。分类资料的组间比较采用χ2检验。计量资料采用±s表示,两组以上均数的组间比较采用One way ANOVA检验,用Bonferroni方法进行两两比较。基因型和等位基因频率采用直接计数法统计,研究对象与Hardy?Weinberg平衡的符合程度,基因型和等位基因频率的组间比较采用χ2检验。

    3结果

    3?1各组E?selectin水平比较表2结果显示,冠心病各证型组患者血清E?selectin水平均高于正常组(P<0?01),但各证型组间比较,差异无显著性意义(P>0?05)。 表2各组E?selectin水平比较①P<0?01,与正常组比较3?2各组E?selectin G98T及S128R基因型比较将符合纳入标准且资料完备的82例应用PCR?RFLP测定基因型,其中正常组16例,痰瘀组45例,血瘀组13例,痰浊组8例,因血瘀组和痰浊组检测例数较少,故将其合并(21例)为非痰瘀组(以与痰瘀互结证候的痰瘀组区别),再进行统计分析。

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