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原发性肝癌组织中肝素酶表达与肝癌侵袭 转移关系的研究

时间:2018-05-18 12:00:51来源:www.xielunwen.net 作者:admin 点击: 16 次
作者:罗志强刘锋邵江华邬林泉 【摘要】目的探讨乙酰肝素酶(HeparanaseHpa)在肝癌中的表达及其与肝癌临床病理特征的关系。方法分别采用RT-PCR和免疫组织化学法检测HpamRNA及Hpa蛋白在肝细胞肝癌、癌旁肝组织及肝癌细胞株中的表达。结果肝癌HpamRNA和蛋白的表达显著高于癌旁及正常肝组织(P<0.05),肝癌组织中HpamRNA的表达与TNM分期、Edmondson分级和复发有关(P<0.05)。

                           作者:罗志强 刘锋 邵江华 邬林泉

【摘要】  目的 探讨乙酰肝素酶( Heparanase Hpa) 在肝癌中的表达及其与肝癌临床病理特征的关系。方法 分别采用RT-PCR 和免疫组织化学法检测Hpa mRNA 及Hpa 蛋白在肝细胞肝癌、癌旁肝组织及肝癌细胞株中的表达。结果 肝癌Hpa mRNA和蛋白的表达显著高于癌旁及正常肝组织(P<0.05) ,肝癌组织中Hpa mRNA 的表达与TNM 分期、Edmondson 分级和复发有关(P<0.05) 。结论 Hpa mRNA 及蛋白在肝癌中高表达,并与肝癌的侵袭转移、复发、预后有关。

【关键词】  肝细胞肝癌 乙酰肝素酶 侵袭 转移 复发

【Abstract】  Objective  The main aim of this investigation is to explore the expression of heparanase  mRNA and protein in hepatocellular carcinoma ( HCC) and its relationship with the clinical pathological features of HCC. Methods  Reverse transcription polymerase chain reaction  (RT-PCR) and immunohistochemical staining were used to detect expression of heparanase mRNA and protein in normal hepatic tissues, tumor tissues and adjacent tissues of hepatocellular carcinoma. Results  The expression of Hpa mRNA and protein in HCC tissues was significantly  higher than that in adjacent tissue and normal hepatic tissues (P<0.05) . It was correlated with TNM classification and recurrence of HCC Edmondson-Steiner’s classification (P<0.05) . Conclusion  Overexpression of the heparanase mRNA and protein relates to the invasion , metastasis , recurrence and prognosis of hepatocellular carcinoma.

    【Key words】  Hepatocellular carcinoma  Heparanase  Invasion  Metastasis  Recurrence    乙酰肝素酶( heparanase , HPA) 是1999 年克隆分离出的一种葡糖苷酸内切酶。它可降解硫酸乙酰肝素(hearan sulfate ,HS) ,破坏细胞外基质和血管基底膜,并促进肿瘤新生血管生成,使肿瘤细胞实现侵袭转移。作者运用RT - PCR 和免疫组织化学法对Hpa mRNA 及Hpa 蛋白在肝细胞肝癌、癌旁肝组织及肝癌细胞株中的表达进行检测,检测33例原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC) 标本中HPA 的基因表达,并结合病人的临床病理学和随访资料,以探讨HPA 可否作为HCC 转移潜能的可靠标志。

    1  临床资料

    1.1  一般资料  新鲜冷冻的标本取自2005 年8 月至2006年4 月南昌大学第二附属医院普外科手术切除并经病理学检查证实的33 例HCC(包括癌和癌旁肝组织) 和9 例肝脏良性肿瘤(取瘤旁肝组织作正常对照)。收集病人临床病理学检查资料,HCC 组中男28 例,女5 例;年龄29~73 岁,平均49 岁。28 例术后6~16 个月内获得随访,占85 %(28/ 33) 。根据手术记录、术后病理学检查报告等,将有癌栓、肝内播散即卫星癌灶和(或) 淋巴结转移的14 例HCC 病人定为高转移复发倾向组。反之,无癌栓、肝内卫星癌灶和(或) 淋巴结转移的19 例HCC 病人为低转移复发倾向组。其中癌灶长径≤5 cm 8例,>5 cm 25例;癌灶包膜完整14 例、不完整19 例;甲胎蛋白(AFP) 阳性26 例、阴性7例; HBsAg 阳性27 例、阴性6 例;合并明显肝硬化18例、无明显肝硬化15 例;肿瘤Edmondson Ⅰ、Ⅱ级13 例、Ⅲ、Ⅳ级20 例; TNM Ⅰ、Ⅱ期18 例、Ⅲ、Ⅳ期15 例。随访有和无转移复发各14 例。肝脏良性肿瘤9 例中男4 例,女5 例;年龄32~65 岁,平均41 岁;其中肝海绵状血管瘤8 例、肝局灶性结节性增生1 例。

    1.2  总RNA 提取和半定量RT-PCR 检测  Trizol 总RNA 分离试剂盒( Gibco) Trizol 一步法提取组织总RNA ,甲醛变性胶电泳鉴定及紫外分光光度仪测定OD 值后,逆转录合成cDNA。AMV 为TaKaRa 公司产品,dNTP 购自上海生物工程公司。HPA 引物参照文献[1]设计,由上海生物工程公司合成, 上游为5’-2 TTCGATCC2CAAGAAGGAATCAAC23 ’, 下游为5-2 GATTCAGTTA2CATGGCATCACTAC-3’,其扩增片段长度为585 bp 。采用β2actin 作为内参照,其引物由上海博亚生物公司合成,上游序列为5’2 TTCCAGCCTTCCTTCCTGG23 ’, 下游为5’2ATTGCTCCTCCTGAGCGCAA23’,扩增片段长度为224 bp。按50μl 反应体系行PCR 扩增。Tag TM DNA 聚合酶为TaKaRa产品。HPA 扩增条件为94 ℃预变性4 min ,后转入94 ℃变性30 s、57 ℃退火45 s、72 ℃延伸1 min 循环,共35 个周期,然后再72 ℃延伸5 min。取10μl 产物于112 %的琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭紫外灯下观察拍照。 

    1.3  免疫组织化学染色方法及结果判定  标本常规甲醛固定取材、脱水、石蜡包埋后做4μm 连续切片,按SP 免疫组织化学染色试剂盒染色步骤进行, Hpa 表达阳性为细胞浆染成棕黄色,在光镜下观察5 个高倍视野,计算阳性细胞数,阳性细胞数≤10 %为阴性表达, > 10 %为阳性表达。

    1.4  统计学处理  结果数据采用χ2 检验或四格表确切概率法分析。

    2  结果

    2.1  HPA mRNA 在肝癌组织中的表达  经RT-PCR 扩增后电泳观察发现33 例HCC 癌组织中有16 例HPA 表达阳性,阳性率为48 %(16/ 33) ;而癌旁肝组织仅1 例HPA 表达呈阳性;9 例正常肝组织均阴性。经统计学处理P 值<0101 分别(前者χ2 值171827 ,P<01005,后者P<0101) ,有显著性差异。见图1。

    2.2  HPA 在肝癌组织中的表达   免疫组织化学染色显示16 例肝癌组织Hpa 蛋白表达阳性,癌旁组织有5 例表达阳性; 9 例正常肝组织均未见表达; 肝癌与癌旁、正常肝组织的蛋白表达有显著性差异(P<0.05)。见图2。

    2.3  HPA mRNA 表达与肝癌临床病理学特征及转移复发的关系  肝癌HPA mRNA 表达与病人年龄、性别、癌灶大小、包膜完整度、HbsAg 状态、AFP 和有无肝硬化等因素无关( P > 0105) ,而与癌灶Edmondson 分级、TNM 分期、转移复发倾向和有无转移复发有关( P < 0105) 。见表1。

    图1  肝素酶mRNA在HCC癌及癌周肝组织中的表达(Mark:DL2000;T1:是某例癌组织标本,于585bp处有条带出现,HPA表达阳性;N1:为相应的癌周组织标本,HPA表达阴性)  图2  肝素酶蛋白在癌组织的表达(sp×200)表1  HPA mRNA 表达与肝细胞癌临床病理学特征及转移复发的关系

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